Массовое параллельное секвенирование РНК плазмы крови человека

Барякин Д.Н.   Семенов Д.В.   Бреннер Е.В.   Курильщиков А.М.   Васильев Г.В.   Брызгалов Л.О.   Чикова Е.Д.   Филлипова Ю.А.   Кулигина Е.В.   Рихтер В.А.

Массовое параллельное секвенирование РНК плазмы крови человека

Докладчик: Барякин Д.Н.

 

РНК являются одним из наиболее многофункциональных биополимеров. РНК участвуют в переносе и реализации генетической информации, транспорте аминокислот, направляют и осуществляют ферментативные реакции. Известно, что внеклеточные жидкости высших организмов содержат РНК. Исследование структуры и биологических функций циркулирующих внеклеточных РНК расширяет фундаментальные знания в области межклеточной коммуникации и путей сигнализации, а также способствует разработке новых диагностических и терапевтических подходов.
Целью данного исследования является детальное описание структуры и форм внеклеточных РНК плазмы крови человека методом массового параллельного секвенирования на платформе SOLiD™, направленное на выявление новых форм регуляторных РНК и установление механизма их действия, разработку новых уникальных и комплексных диагностических маркеров заболеваний человека.
Суммарную РНК выделили из образцов плазмы крови 8 здоровых доноров — 4 мужчин и 4 женщин, в возрасте от 20 до 60 лет. Для получения полных кДНК библиотек циркулирующие РНК подвергали дефосфорилированию с последующим  5′-фосфорилированием. Молекулы РНК с 3′-гидроксильной и 5′-фосфатной группами лигировали с адаптерами и подвергали обратной транскрипции. Полученные 8 персонализированных кДНК библиотек амплифицировали и секвенировали на платформе SOLiD™. Полученные последовательности длиной 35 нуклеотидов (в количестве от 31 до 65 миллионов на библиотеку) выравнивали с известными последовательностями ДНК и РНК человека, классифицировали и количественно сравнивали двумя независимыми подходами, с помощью программного обеспечения BioScope™ и Bowtie/Cufflinks.
Было обнаружено, что совокупность РНК плазмы крови человека представляет собой набор фрагментов рРНК, мРНК, транскриптов митохондрий, мкРНК, мцРНК, мяРНК, мяоРНК, а также не аннотированных ранее транскриптов. Вклад фрагментов митохондриальных транскриптов в общий набор циркулирующих РНК, а также высокая плотность покрытия последовательностей мтДНК указывают на присутствие в системной циркуляции митохондрий в составе апоптотических телец. Сравнение представленности отдельных форм мкРНК с данными литературы позволяет предположить, что существенную часть РНК плазмы крови составляют РНК экзосом и микровезикул. Набор предполагаемых мРНК мишеней циркулирующих мкРНК указывает на то, что мкРНК плазмы крови участвуют в регуляции гемопоэза. Расширенный анализ найденных последовательностей позволил выявить следовые количества вирусных и бактериальных транскриптов в системной циркуляции.
Полученная база данных последовательностей РНК плазмы крови здоровых доноров является основой для поиска и разработки новых диагностических РНК-маркеров заболеваний человека, а также открывает новые аспекты межклеточного обмена информацией.

 

 Работа поддержана грантами: РФФИ № 10-04-01386-а, РФФИ № 10-04-01442-а, ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» № 02.740.11.0715